Der Spieler übernimmt die Kontrolle über Chell, eine junge Frau, die als Testsubjekt für die Forschungseinrichtung Aperture Science Enrichment Center der Aperture Laboratories fungiert. Aperture Laboratories ist ein Konkurrenzunternehmen der Black Mesa Research Facility, in der Half-Life spielt.
Die Handlung beginnt in einem nur mit dem Nötigsten ausgestatteten Glaskubus. In dieser sterilen, mit Überwachungskameras versehenen Umgebung wird der Spieler von der weiblichen Computerstimme des Genetic Lifeform and Disk Operating System „GLaDOS“ begrüßt und aufgefordert, an Tests teilzunehmen. Diese bestehen aus als „Testkammern“ bezeichneten Hindernisparcours, in denen unter anderem würfelformige Boxen gesucht und auf Bodenschaltern abgelegt werden müssen. Als Belohnung für den erfolgreichen Abschluss aller 19 Kammern wird immer wieder ein Kuchen versprochen (in der 19. Kammer wird sogar auf der Info-Tafel am Ende ein Kuchen angezeigt).
Schnell zeigt sich, dass GLaDOS über eine gespaltene Persönlichkeit verfügt, die zwischen Fürsorglichkeit, Gleichgültigkeit und später auch Feindseligkeit schwankt. Die Testkammern werden durch Säurebecken, Energiestrahlen und Selbstschussanlagen zunehmend lebensgefährlich. Neben kurzen Aussetzern GLaDOS’ und ihrer Fähigkeit, Euphemismen zu verwenden und zu lügen, wirken auch kleine Areale abseits der eigentlichen Testkammern beunruhigend. Dort befinden sich neben aus Computern improvisierten Kochern und Nahrungsvorräten Notizen wie „She's watching you!“ („Sie beobachtet dich!“) oder „The cake is a lie!“ („Der Kuchen ist eine Lüge!“) an den Wänden dieser relativ schmutzigen, düsteren Räume.
Am Ende der letzten Testkammer soll Chell auf einer beweglichen Plattform in eine Brennkammer gefahren und getötet werden – laut GLaDOS’ Aussage braucht sich die Protagonistin um die Ausrüstung von Aperture Science keine Sorgen zu machen, da sie für derart hohe Temperaturen ausgelegt sei. Chell kann aber dank des [lexicon]Portal[/lexicon] Devices entkommen. Die zweite Hälfte des Spiels handelt – begleitet von den wie gewohnt wechselmütigen und unterhaltsamen, teils mit umgekehrter Psychologie gefüllten Kommentaren der nun deutlich verärgerten GLaDOS – von der Flucht durch die Wartungsareale des Enrichment Centers, die keine Ähnlichkeiten mit den sterilen Testkammern aufweisen und offenbar schon seit langer Zeit verlassen sind. Auch in den Wartungsarealen begegnet Chell des Öfteren Notizen der Person, die schon vorher die Wände bekritzelt hatte, sie scheint aber zu diesem Zeitpunkt die einzige Person zu sein, die sich im Enrichment Center befindet. Neben Notizen hat diese Person an manchen Stellen auch Pfeile an die Wand gekritzelt, die dem Spieler den Weg zeigen.
Chell findet GLaDOS’ vermeintlichen Systemkern und in einem abschließenden Kampf gelingt es ihr, den Computer zu zerstören. Sie wird ohnmächtig und wacht anscheinend gerettet auf dem Parkplatz des Geländes zwischen brennenden Trümmern auf. Im Enrichment Center aktivieren sich einige Systeme, und ein Greifarm löscht die Kerze eines bereitstehenden Kuchens. Im Abspann singt GLaDOS, dass sie sich über den Erfolg Chells freue und weiterforschen werde, denn sie (GLaDOS) lebe und es gehe ihr gut (der Titel des Lieds ist Still Alive, also Noch am Leben). Es bleibt unklar, ob die zweite Hälfte der Handlung mit der Flucht zum eigentlichen Test von GLaDOS gehört oder nicht.
Durch ein späteres Update wurde das Ende des Spiels in der PC-Version leicht geändert: Chell liegt nun nicht mehr nur auf dem Parkplatz, sondern wird dort von einem Roboter entdeckt und weggezogen.[2]
Die Handlung selbst erzählt nur wenig über das Universum von Half-Life. Die einzigen Hinweise darauf sind eine projizierte Präsentation in einem verlassenen Konferenzraum, in dem die Forschungseinrichtung Black Mesa als Konkurrent dargestellt wird, sowie eine Erwähnung dieser im (humorvollen) Abschlusslied. In der (zusammen mit [lexicon]Portal[/lexicon] veröffentlichten) Episode 2 von Half-Life 2 wird am Ende das Schiff Borealis von Aperture Science als Ziel der nächsten Episode offenbart.
